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资料整理|北京博信华助力新型冠状病毒检测,希望给您提供最全面的方案!

发布时间:2020/7/31 15:15:02   点击量:26

北京博信华公司全力支持新型冠状病毒的检测和防控工作!作为赛默飞的代理商,我们可以提供从样本前处理、核酸提取、基因扩增、数字PCR、测序产品和防护用品耗材,全方面检测和排除其他相关病原的方案。

目前在全国和省级的的疾控中心当中,都装备有赛默飞的分子检测平台进行病毒检测,溯源和确认等工作。本文结合中华医学杂志,刊登的《新型冠状病毒肺炎病毒核酸检测专家共识》(简称《共识》),推荐一套完备的实验室配套设施。

 

一、PCR实验室平面布局

PCR实验室设计的核心问题是如何避免污染。因此,实验室的平面布局、空调通风系统设计、气流控制都需要围绕这个核心问题进行。下面主要对布局做介绍。

 PCR实验室原则上分为四个单独的工作区域:

1.试剂贮存和准备区

2.标本制备区(核酸提取室和加样区)

3.基因扩增区

4.扩增产物分析区

请注意:1).以上第3和第4区,可根据情况合并;2).PCR体系的配置,可在基因扩增实验室的试剂配置区或是单独的专用实验室;3).模板的加液,需要在标本制备区生物安全柜中进行。4).为避免交叉污染,进入各个工作区域严格遵循单一方向进行,即只能从试剂贮存和准备区→标本制备区→扩增反应混合物配制和扩增区。5).各实验区之间的试剂及样品传递应通过传递窗进行。(此图来源于BIOBASE净化工作室)

 

 

 

根据各区实验内容的不同配备相应的设备和仪器,其中包括:生物安全柜(A2型、B2型),冰箱、全自动核酸提取仪(推荐磁珠法)、高速离心机、金属浴、荧光定量PCR仪、数字PCR仪,各型号高效耐用的移液器等。

 

二、2019-nCoV核酸检验流程

(一)、标本接收保存

接收采集的口咽拭子后,若无法及时检测,可于4 ℃条件下短期(不超过24 h)保存,若需长期保存,可将标本于-70℃或更低的温度下保存。需要配备4 ℃冰箱或超低温冰箱。(《共识》)

℃冰箱: 

 

-20℃冰箱

 

 

Performance系列冰箱 

 

四种型号可选:368L,490L,651L,793L

 

 

- 外部箱体采用重型工业级冷轧钢设计,粉末涂层外表面

- 门把手可单手操作,兼容挂锁,可选配独特钥匙锁

- 可加热的自动真空压力平衡口,方便快速再次开门

- 冷凝器过滤器,易于拆卸,可水洗

 

 

(二)、标本前处理

(1)病毒灭活

口咽拭子和鼻咽拭子:可直接用于核酸提取,当实验室条件不够时可增加病毒灭活步骤,增加病毒灭活步骤可能会降低核酸检测的灵敏度。

56 ℃,灭活时间45 min。可根据提取试剂在标本裂解时所采用的温度调整灭活温度,但不能低于56 ℃;提高温度后可适当缩减灭活时间。水浴或金属浴都可。水浴需要注意防止标本采集管漂浮。每隔10 min将标本摇匀1次(《共识》);金属浴需要有15ml离心管加热模块。

 

金属浴

 

 

 

(2)核酸提取和加样

将灭活后的标本从水浴锅中取出,在生物安全柜内对密封袋进行消毒,打开密封袋后,即时用75%酒精消毒,取出标本,1500×g离心5 min后冰浴3-5 min。在生物安全柜内打开标本采集管。为保证人员安全和核酸提取纯度和效率,建议采用基于磁珠吸附的自动化核酸提取方法。(《共识》)

 

1300系列A2生物安全柜

 

 

 

凭借出色的“4C”能力,在医疗、疾控、科研、制药等行业有着广泛的应用 

 

- 独有的无碳刷直流双风机,确保气流稳定平衡,气流波动超过20%,立即报警,确保人员和环境安全。

- 新型风压测速仪和数字确认式气流补偿系统,及时掌控生物安全柜状态。

- 10˚ 前窗倾角的搁手架设计,可调节支架,低噪音设计,更有利于客户使用,防止不安全事故发生。

 

通用台式离心机 

 

 

 

Thermo Scientific™ SorvallST 16/ 16R台式离心机,较小实验台面上的大容量离心选择。

- Auto-Lock III 转头自锁系统, 按下按键,即可完成转头安装、拆卸,确保转头固定 , 无需借助任何辅助工具。

- Fiber lite转子, 强度高,耐腐蚀,重量轻,15 年质保 

- 设计紧凑,节省实验室空间。

 

全自动核酸提取仪

 

 

 

KingFisher Flex基于专利的磁棒式转移磁珠技术,最高通量每批同时处理96个样品,仅需15-40分钟(根据具体样品和程序),使您从繁琐的样品提取工作中解脱,并获得高质量的产物,为下游检测带来精确结果。

(3)核酸扩增体系的准备:

核酸提取完成后,立即将提取物进行封盖处理。在生物安全柜内将提取核酸加至PCR扩增反应体系中。(《共识》)

 

封膜机

 

 

提供一系列的盖垫,粘合膜和热封膜以及密封设备,方便您保护样品。热封机可轻松实现整齐、牢固的密封微孔板,包括PCR板,避免传统粘性膜贴歪、贴不紧等情况的发生;对微孔板进行热密封处理,不再需要膜上有黏合剂,不仅能确保出色的密封效果,也能避免黏合剂与储存样品发生反应,污染样品,确保检测的准确性。

高效耐用-F2移液器

 

 

- 活塞设计,增加50%吹出能力,减少挂壁和残留,提供精准度 

- 量程调节具有卡子设计,咬合紧密,液量准确,避免误操作引起量程改变。

- 采用极佳的耐热材质,可整支高温高压灭菌,无需拆卸,可耐受UV辐射灭菌,酒精擦拭等;

- 符合人体工程学设计,重量轻,舒适灵活,宽阔指靠,方便移液间隙休息。

- 数字显示并且微量刻度标尺,实现微调和粗调完美的结合

 

E1-ClipTip云端电动移液器

 

 

当所有的人体工效学优点齐聚一身时,移液就是一种舒适、安全、享受的体验。

- 独一无二的间距调节窗口:预设24、48、96、384孔板标记,间距调节又快又准。

- 电动退吸头装置,使退吸头操作毫不费力

- 旋转式显示屏,可调节的指靠,舒适的推握式用力,操作自如

- 云端数据管理、程序编辑、分享、下载、多用户管理等,蓝牙/USB传输,实现连接中的移液。

- 云端程序库,预置qPCR、核酸提取等多种试剂盒的移液程序,一键下载,确保移液更优化更高效。

 

 

(三)、核酸扩增

(1)核酸扩增:

将扩增体系放入扩增仪,核对扩增程序是否与试剂说明书相符,启动扩增程序,待反应开始后离开实验室。

根据病毒RNA序列,中国国家疾病预防控制中心公布了检测试剂的引物和探针序列;已有7种检测试剂盒获得NMPA批准,应用于临床检测。

 

《共识》试剂准备,至少含2019-nCoV基因的两个位点(开放读码框1a/b、核壳蛋白N或E结构蛋白),反应体系大,加样量大;检测试剂最好能与核酸提取仪配套使用,此外可选用引物不同的试剂盒便于对结果复核。

国家疾控中心已采用QuantStudio7荧光定量PCR仪+微流体芯片进行呼吸道疾病检测。

QuantStudio7荧光定量PCR仪

 

微流体芯片特点:多重Qpcr,快速,高通量。一个微量样品可一次检测多项指标,一板可检测8个样品。应用于呼吸道、肠道等疾病检测,公共卫生医疗事件检测。最新第二代芯片包含新冠状病毒微流体芯片已研制成功。

 

 

 

(2).扩增产物处理:

扩增后产物置于含1 mol/L的稀盐酸中,应将产物全部浸泡至液体中,浸泡后将扩增产物转移出实验室。如果扩增后产物未在扩增区浸泡稀盐酸,可将扩增产物用一次性医疗垃圾袋装好扎紧,转移至扩增产物废物处理区。

 

(四)、判读结果

1判读为"检出"的条件:

需满足以下任一条:(1) ORF1ab和N基因同时阳性时,判定为阳性;(2)若仅ORF1ab或N基因其中之一检测结果阳性时,需重新提取原标本的核酸进行复查,复查后ORF1ab或N基因仍为阳性时,判定为阳性。(《共识》)

(2)判读为"可疑"结果的处理:

当出现以下两种情况时为"可疑":(1)2个位点的Ct值位于阳性Ct值和阴性Ct值之间或其中1个位点判读为阳性,另1个位点的Ct值位于阳性Ct值和阴性Ct值之间(具体请参考试剂盒说明书);(2)2个位点中的1个位点为阴性,另1个位点的Ct值位于阳性Ct值和阴性Ct值之间。对于"可疑"阳性结果,建议对标本重新进行一次核酸提取,并与该标本前一次提取的核酸同时扩增检测,结合两次检验,2个位点可判断为"阳性"则可报告"检出",否则应报告"可疑"。当报告为"可疑"时,实验室应考虑以下措施:(1)更换不同厂家的试剂盒重复实验或采用敏感度更高的方法,如数字PCR方法进一步确定;(2)建议临床重新采集标本或更换部位采集标本再次检测。(《共识》)

(3)判读为"未检出"结果的处理:

当两个位点扩增结果无反应,可报告"未检出",并对结果进行解释,此情况可能是病毒载量低于检出限,应结合临床分析。当临床体征及其他检查高度怀疑2019-nCoV感染时,建议重新采集标本或更换部位采集标本再次检测。(《共识》)

(五)、可疑结果的处理

除了更换不同厂家的试剂盒重复实验外,避免检测中的假阴性结果和进一步鉴别疑似阳性结果还可以采用敏感度更高的方法,如数字PCR方法进一步确定。(《共识》)

数字PCR仪

 

数字PCR方法是目前核酸检测灵敏度最高的方法,数字PCR可以直接计算目标序列的拷贝数,因此无需依赖于对照样品和标准曲线就可以进行精确的绝对定量检测;数字PCR采用对核酸分子进行绝对定量的方式,不依赖于标准曲线和参照样本,直接检测目标序列的拷贝数。这种检测方式具有比传统qPCR更加出色的灵敏度和特异性、精确性,这项技术在复杂背景下极微量核酸样本检测具有极大的潜力和应用价值。此外对于病毒载量进行精确定量,对于判断病程和预后情况,以及相关治疗药物的药效药理评估具有不可估量的巨大作用。

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